Eletroforese em gel

(Equipamento de eletroforese em gel).

Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o formato da moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.

A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.

Como funciona

Cada molécula de proteína se liga a um grande número de moléculas do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) carregado negativamente, que supera a carga intrínseca da proteína e faz com que ela migre em direção ao eletrodo positivo, quando uma voltagem é aplicada. As proteínas do mesmo tamanho tendem a migrar através do gel com velocidades similares, pois sua estrutura nativa será completamente desdobrada pelo SDS, de maneira a que elas se liguem a uma mesma quantidade de SDS tendo, portanto, a mesma quantidade de cargas negativas. As proteínas maiores, com mais carga, são submetidas a forças elétricas maiores e também a um retardamento maior. Livres em solução, os dois efeitos seriam anulados, mas nas malhas do gel poliacrilamida, que age como uma peneira molecular, as proteínas maiores são retardadas muito mais do que as menores. Como resultado, uma mistura complexa de proteínas é fracionada em uma série de diferentes bandas de proteínas arranjadas de acordo com sua massa molecular. As proteínas majoritárias são facilmente detectadas corando-se as proteínas do gel com um corante como o azul Coomassie, e mesmo as proteínas menos abundantes são visualizadas em géis tratados com coloração de prata ou ouro (com o qual pequenas quantidades, como 10 ng de proteína, podem ser detectadas em uma banda).

Tipos de eletroforese

Eletroforese em gel de agarose Nesse caso, a agarose é utilizada como gel para a eletroforese. A agarose é um polissacarídeo e forma uma rede que prende as moléculas durante a migração. Dependendo da concentração de agarose, há uma diferença no gradiente de separação. Para preparar um gel de agarose, faz-se a mistura entre o pó de agarose e a solução-tampão (TBE). Após fundir, coloca-se brometo de etídio, que fará o DNA ou RNA "brilhar" quando exposto ao UV. A menores temperaturas o gel ganha consistência. Um detalhe importante é a colocação do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria poços que serão utilizados para a colocação das amostras.

Podemos ver este processo como uma corrida. Cada um é colocado numa pista e na presença de uma corrente eléctrica vai deixando o seu rasto. São estes rastos que vamos comparar.

Eletroforese em gel de poliacrilamida A poliacrilamida também pode ser utilizada com gel para a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto a bisacrilamida tem forma de "T". Misturando essas duas moléculas, temos a formação de uma "rede". Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação.

Para preparar um gel de poliacrilamida, devem-se misturar as duas substâncias formadoras nas concentrações desejadas, colocá-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como catalizadores da polimerização.

Eletroforese desnaturante Normalmente feita em gel de agarose, inclui um agente desnaturante (normalmente uréia), o que ajuda a tornar a separação melhor entre moléculas que apresentam diferenciação em suas estruturas secundárias.

Eletrofrese capilar Funciona como a eletroforese normal, porém o gel e a amostra estão dentro de um capilar e a amostra é detectada automaticamente. Este processo é atualmente utilizado em sequenciadores de DNA.